Genmodifisering av HNF1B i zebrafisk for å identifisere sykdomsmekanisme ved MODY5

Prosjektsamandrag

Heterozygote tap av funksjon mutasjoner i hepatocytt nukleær faktor genene HNF4A, HNF1A og HNF1B forårsaker klinisk distinkte subtyper av monogen diabetes: Maturity-onset diabetes of the young (MODYs). Selv om MODY er sjelden sammenlignet med type 1 og type 2 diabetes så er det en alvorlig sykdom som varer livet ut, og med økt risiko for hjertesykdom, nyresykdom og blindhet. I tillegg til diabetes ved redusert insulinutskillelse fra pankreas kan pasienter også lide fra andre sykdomer i ikke-pankreatiske vev, som nyre, lever eller reproduksjonssystemet. Ettersom studier av de molekylære årsakene til sykdomsutvikling i slike vev er begrenset, så er det fortsatt uklart hvordan mutasjoner i disse HNF genene resulterer i et slikt vidt spekter av vevsspesifikk sykdom. Formålet med prosjektet er å karakterisere de underliggende sykdomsmekanismene ved HNF mutasjoner, i nyre og pankreas. ettersom sebrafisk har vist seg å representere et relevant modellsystem for human sykdom, og diabetes (type 2 diabetes), så vil vi bruke denne til å studere de basale mekanismene for sykdom i multiple organer ved MODY5 (HNF1B genmutasjon). Sykdomsuvikling fra embryo til voksen fisk vil bli studert ved organ/vev imaging (in vivo/in situ), molekylært (transkriptom), og ved komplekse big data anlyser ved maskin læring. Langsiktig prosjektfunn har mulighet til å veilede framtidig behandling av nyresykdom ved MODY5, og har relevans for andre mer vanlige former for diabetes.

Metode

The MODY5 model will be made by CRISPR/Cas9 technology in tissue specific GFP-transgenic lines (relevant lines available at ZIRC: ZL1733 (nkx2.2a:GFP) or ZL1i669(ins:GFP), for pancreas endocrine and beta-cell content), and the Tg(wt1b:EGFP) zebrafish line for kidney development, to facilitate in vivo monitoring (by fluorescence microscopy) of tissue-based organ development. In these zebrafish lines, naturally occurring patient specific mutation (larger deletion- or premature termination mutations) in HNF1B A/B orthologue genes will also be incorporated. CRISPR efficiency will be tested by embryo genomic DNA isolation (fin-clips), PCR and genomic sequencing. Phenotype screening will be performed in the injected F0 individuals. If no phenotype is visible in F0 generations, we will cross F0 founders to obtain F1 heterozygous carrier lines. Stable heterozygous F1 carriers will be crossed to obtain homozygous progeny. Measurements of signs of diabetes by fasting and postprandial glucose/insulin measurements will be performed after blood collection in adult fish. Blood collection protocols are available for adult fish